Advanced search
1 file | 2.40 MB

Estrogen Receptor-Mediated Effects in the Gonadotropic LBetaT2 and AlphaT3-1 Cell lines

(2008)
Author
Promoter
J Kaufman
Organization
Abstract
Bij man en vrouw wordt het fysiologische proces dat verantwoordelijk is voor de vruchtbaarheid gereguleerd door de hypothalamo-hypofysaire gonadale as. Het gonadotropine-releasing hormoon (GnRH) stimuleert de productie van de gonadotropines follikel stimulerend hormoon (FSH) en luteïniserend hormoon (LH) door de hypofysaire gonadotropen. LH is verantwoordelijk voor de synthese van de geslachtshormonen ter hoogte van de gonaden, terwijl FSH de gametogenese moduleert. Via een feedback terugkoppeling naar de hypothalamus en de hypofyse, controleren de gonadale geslachtshormonen, waaronder het 17-β-estradiol (E2), op hun beurt de gonadotropine secretie. Voor de studie van oestrogene effecten ter hoogte van de hypofyse werd vroegergebruik gemaakt van primaire hypofysaire celculturen en weefselexplanten. De interpretatie van de bekomen data wordt echter bemoeilijkt omdat gonadotropen kunnen interageren met andere hypofysaire celtypes. Een andere beperking is het feit dat gonadotropen slechts 10% uitmaken van de totale hypofysaire celpopulatie. In het begin van de jaren negentig heeft de groep van P. Mellon twee geïmmortaliseerde, gonadotrope cellijnen ontwikkeld door middel van gerichte oncogenese in transgene muizen. Deze LβT2 en αT3-1 gonadotrope cellijnen brengen de gemeenschappelijke α-gonadotropine subunit en een functionele GnRH receptor tot expressie, maar verschillen in differentiatiegraad. De LβT2 cellijn vertoont structurele en functionele karakteristieken van volwassen hypofysaire gonadotropen. De αT3-1 cellijn daarentegen is minder gedifferentieerd door de afwezigheid van gonadotropine β-subunits. Dit heeft als gevolg dat αT3-1 cellen niet in staat zijn om LH en FSH te secreteren. Sinds zijn ontwikkeling diende de LβT2 cellijn als gouden standaard in het onderzoek naar de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij gonadotropine productie. In het huidige project hebben we gebruik gemaakt van de αT3-1 en LβT2 cellijnen om de effecten van oestrogenen en (anti-)oestrogene componenten ter hoogte van de hypofysaire gonadotropen te bestuderen. In het eerste luik van ons experimenteel onderzoek (hoofdstuk 4.1) beschrijven we de effecten van E2 op GnRH-gemedieerde LH productie in de LβT2 cellijn. GnRH stimuleerde LH secretie op een dosisafhankelijke manier, behalve op de eerste behandelingsdag. Dit suggereert dat het “self-priming” effect van GnRH in gonadotropen bewaard is gebleven in de LβT2 cellijn. Dagelijks herhaalde blootstelling aan hoge concentraties GnRH zorgde echter voor een gedaalde LH vrijstelling. Dit kon niet verklaard worden door GnRH receptor downregulatie of desensitisatie, aangezien de expressie van het LHβ-subunit gen dosis-afhankelijk werd gestimuleerd, ook door hogere concentraties van GnRH. Andere factoren, zoals post-translationele processen of opslag in de vesikels kunnen verstoord zijn in de LβT2 cellijn. In tegenstelling tot beperkte literatuurgegevens, bleek E2 geen invloed te hebben op GnRH-gestimuleerde LH secretie. Dit kan verklaard worden door de afwezigheid van een functionele oestrogeen receptor α (ERα) in de LβT2 cellijn. Bovendien blijkt ERα-gestuurde signaaltransductie verstoord te zijn, aangezien E2-gemedieerde effecten afwezig bleven na overexpressie van de oestrogeen receptor. Dit wordt verder bevestigd door de relatief sterke expressie van een ERα messenger RNA splicing variant in vergelijking met normale ERα expressie. Theoretisch gezien codeert deze splice variant voor een receptoreiwit waarvan het ligand bindende domein quasi volledig ontbreekt. Een mogelijke hypothese is het feit dat deze variant kan interfereren met normale ER-gestuurde signaaltransductie in de LβT2 cellijn. Uit bovenstaande bevindingen kunnen we afleiden dat de gonadotrope LβT2 cellijn niet geschikt is voor in vitro studies naar oestrogene effecten ter hoogte van de hypofysaire gonadotropen. Daarom ging de voorkeur uit naar de minder gedifferentieerde αT3-1 cellijn. Deze data zijn voorgesteld in chapter 4.2. Proliferatiestudies en transfecties met een oestrogeen-responsief reporter plasmide hebben aangetoond dat αT3-1 cellen een functionele ERα tot expressie brengen. Ondanks de eerder matige effecten van E2 op αT3-1 celgroei zorgden de selectieve oestrogeenreceptor modulator (SERM) 4-hydroxy-tamoxifen en het pure anti-oestrogeen ICI 182,780 (fulvestrant) voor een sterke inhibitie van zowel basale celgroei als van ERα-gestuurde gentranscriptie. Dit eerder onverwachte resultaat kan verklaard worden door interacties tussen ERα en de insulin-like growth factor I (IGF-I) receptor in de αT3-1 cellijn. Dit wordt bevestigd door het feit dat IGF-I in staat was om ERα-gestuurde genexpressie dosis-afhankelijk te stimuleren. De anti-oestrogeen-geïnduceerde inhibitie van basale celgroei en ERα-gemedieerde genexpressie werd bovendien geblokkeerd door het toevoegen van stijgende concentraties IGF-I. Een andere belangrijke factor is het feit dat IGF-I in staat was om ERα fosforylatie ter hoogte van serine residue 118 te stimuleren. Deze fosforylatie is namelijk één van de sleutelvoorwaarden voor een optimale ERα transcriptionele activiteit. Uit deze data kunnen we afleiden dat IGF-I een invloed kan hebben op ERα-gemedieerde signaaltransductie in hypofysaire gonadotropen. Dit wordt bevestigd door een beperkt aantal rapporten in de literatuur, waarin beschreven wordt dat IGF-I LH secretie kan beïnvloeden. Extra onderzoek is dus noodzakelijk om dit complexe mechanisme verder uit te pluizen. Uit bovenstaande resultaten is gebleken dat de minder gedifferentieerde αT3-1 cellijn kan aangewend worden als een in vitro model voor de studie van oestrogene effecten in hypofysaire gonadotropen. In de gedifferentieerde LβT2 cellijn daarentegen bleken oestrogenen geen invloed te vertonen op LH en FSH productie. Het bestaan van een oestrogeen-responsieve gonadotrope cellijn opent veel mogelijkheden voor het onderzoek naar de mechanismen van oestrogeen-actieve componenten ter hoogte van de gonadotropen. De laatste jaren is er namelijk verhoogde interesse naar het gebruik van fyto-oestrogenen (plantaardige oestrogene stoffen) als alternatief voor de klassieke hormonale substitutietherapie. Meer en meer studies tonen ook aan dat blootstelling aan xeno-oestrogenen (oestrogeen-actieve chemicaliën aanwezig in het milieu) de vruchtbaarheid negatief kunnen beïnvloeden. Vanuit de farmaceutische industrie wordt bovendien sterk geïnvesteerd in de ontwikkeling van SERMs voor de behandeling van oestrogeen-afhankelijke aandoeningen zoals osteoporose en borstkanker. Aangezien gonadotropen een sleutelrol spelen in de regulatie van de vruchtbaarheid, vormen ze dus een mogelijk doelwit voor dergelijke stoffen. Momenteel wordt in ons laboratorium de αT3-1 cellijn aangewend voor de analyse van fyto-oestrogeen geïnduceerde effecten ter hoogte van gonadotropen. In hoofdstuk 5.9 tonen we een voorbeeld van een dergelijk experiment. Uit onze studie kunnen we concluderen dat de gedifferentieerde gonadotrope LβT2 cellijn niet geschikt is voor ons onderzoek omwille van de aangetoonde afwezigheid van enige oestrogene respons. Daarentegen blijkt de minder gedifferentieerde αT3-1 cellijn een bruikbaar in vitro model te zijn door de aanwezigheid van een functionele ERα,zoals aangetoond door middel van proliferatie- en transfectiestudies. De geobserveerde inhibitie van groei- en ERα-gestuurde genexpressie kan mogelijk verklaard worden door interacties tussen ERα en de IGF-I receptor. Deze data suggereren dat IGF-I een belangrijke rol kan spelen in de regulatie van ERα-gestuurde effecten ter hoogte van hypofysaire gonadotropen. Vanuit dit standpunt kunnen we concluderen dat de αT3-1 een geschikt in vitro model is voor het onderzoeken van oestrogeen-actieve componenten zoals fyto-oestrogenen, xeno-oestrogenen en SERMs met als finaal doel het moleculaire werkingsmechanisme van deze stoffen ter hoogte van de gonadotropen verder uit te spitten.

Downloads

  • Thesis def.pdf
    • full text
    • |
    • open access
    • |
    • PDF
    • |
    • 2.40 MB

Citation

Please use this url to cite or link to this publication:

Chicago
Eertmans, F. 2008. “Estrogen Receptor-Mediated Effects in the Gonadotropic LBetaT2 and AlphaT3-1 Cell Lines.”
APA
Eertmans, F. (2008). Estrogen Receptor-Mediated Effects in the Gonadotropic LBetaT2 and AlphaT3-1 Cell lines.
Vancouver
1.
Eertmans F. Estrogen Receptor-Mediated Effects in the Gonadotropic LBetaT2 and AlphaT3-1 Cell lines. 2008.
MLA
Eertmans, F. “Estrogen Receptor-Mediated Effects in the Gonadotropic LBetaT2 and AlphaT3-1 Cell Lines.” 2008 : n. pag. Print.
@phdthesis{471674,
  abstract     = {Bij man en vrouw wordt het fysiologische proces dat verantwoordelijk is voor de vruchtbaarheid gereguleerd door de hypothalamo-hypofysaire gonadale as. Het gonadotropine-releasing hormoon (GnRH) stimuleert de productie van de gonadotropines follikel stimulerend hormoon (FSH) en lute{\"i}niserend hormoon (LH) door de hypofysaire gonadotropen. LH is verantwoordelijk voor de synthese van de geslachtshormonen ter hoogte van de gonaden, terwijl FSH de gametogenese moduleert. Via een feedback terugkoppeling naar de hypothalamus en de hypofyse, controleren de gonadale geslachtshormonen, waaronder het 17-\ensuremath{\beta}-estradiol (E2), op hun beurt de gonadotropine secretie. Voor de studie van oestrogene effecten ter hoogte van de hypofyse werd vroegergebruik gemaakt van primaire hypofysaire celculturen en weefselexplanten. De interpretatie van de bekomen data wordt echter bemoeilijkt omdat gonadotropen kunnen interageren met andere hypofysaire celtypes. Een andere beperking is het feit dat gonadotropen slechts 10\% uitmaken van de totale hypofysaire celpopulatie. In het begin van de jaren negentig heeft de groep van P. Mellon twee ge{\"i}mmortaliseerde, gonadotrope cellijnen ontwikkeld door middel van gerichte oncogenese in transgene muizen. Deze L\ensuremath{\beta}T2 en \ensuremath{\alpha}T3-1 gonadotrope cellijnen brengen de gemeenschappelijke \ensuremath{\alpha}-gonadotropine subunit en een functionele GnRH receptor tot expressie, maar verschillen in differentiatiegraad. De L\ensuremath{\beta}T2 cellijn vertoont structurele en functionele karakteristieken van volwassen hypofysaire gonadotropen. De \ensuremath{\alpha}T3-1 cellijn daarentegen is minder gedifferentieerd door de afwezigheid van gonadotropine \ensuremath{\beta}-subunits. Dit heeft als gevolg dat \ensuremath{\alpha}T3-1 cellen niet in staat zijn om LH en FSH te secreteren. Sinds zijn ontwikkeling diende de L\ensuremath{\beta}T2 cellijn als gouden standaard in het onderzoek naar de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij gonadotropine productie. In het huidige project hebben we gebruik gemaakt van de \ensuremath{\alpha}T3-1 en L\ensuremath{\beta}T2 cellijnen om de effecten van oestrogenen en (anti-)oestrogene componenten ter hoogte van de hypofysaire gonadotropen te bestuderen. In het eerste luik van ons experimenteel onderzoek (hoofdstuk 4.1) beschrijven we de effecten van E2 op GnRH-gemedieerde LH productie in de L\ensuremath{\beta}T2 cellijn. GnRH stimuleerde LH secretie op een dosisafhankelijke manier, behalve op de eerste behandelingsdag. Dit suggereert dat het {\textquotedblleft}self-priming{\textquotedblright} effect van GnRH in gonadotropen bewaard is gebleven in de L\ensuremath{\beta}T2 cellijn. Dagelijks herhaalde blootstelling aan hoge concentraties GnRH zorgde echter voor een gedaalde LH vrijstelling. Dit kon niet verklaard worden door GnRH receptor downregulatie of desensitisatie, aangezien de expressie van het LH\ensuremath{\beta}-subunit gen dosis-afhankelijk werd gestimuleerd, ook door hogere concentraties van GnRH. Andere factoren, zoals post-translationele processen of opslag in de vesikels kunnen verstoord zijn in de L\ensuremath{\beta}T2 cellijn. In tegenstelling tot beperkte literatuurgegevens, bleek E2 geen invloed te hebben op GnRH-gestimuleerde LH secretie. Dit kan verklaard worden door de afwezigheid van een functionele oestrogeen receptor \ensuremath{\alpha} (ER\ensuremath{\alpha}) in de L\ensuremath{\beta}T2 cellijn. Bovendien blijkt ER\ensuremath{\alpha}-gestuurde signaaltransductie verstoord te zijn, aangezien E2-gemedieerde effecten afwezig bleven na overexpressie van de oestrogeen receptor. Dit wordt verder bevestigd door de relatief sterke expressie van een ER\ensuremath{\alpha} messenger RNA splicing variant in vergelijking met normale ER\ensuremath{\alpha} expressie. Theoretisch gezien codeert deze splice variant voor een receptoreiwit waarvan het ligand bindende domein quasi volledig ontbreekt. Een mogelijke hypothese is het feit dat deze variant kan interfereren met normale ER-gestuurde signaaltransductie in de L\ensuremath{\beta}T2 cellijn. Uit bovenstaande bevindingen kunnen we afleiden dat de gonadotrope L\ensuremath{\beta}T2 cellijn niet geschikt is voor in vitro studies naar oestrogene effecten ter hoogte van de hypofysaire gonadotropen. Daarom ging de voorkeur uit naar de minder gedifferentieerde \ensuremath{\alpha}T3-1 cellijn. Deze data zijn voorgesteld in chapter 4.2. Proliferatiestudies en transfecties met een oestrogeen-responsief reporter plasmide hebben aangetoond dat \ensuremath{\alpha}T3-1 cellen een functionele ER\ensuremath{\alpha} tot expressie brengen. Ondanks de eerder matige effecten van E2 op \ensuremath{\alpha}T3-1 celgroei zorgden de selectieve oestrogeenreceptor modulator (SERM) 4-hydroxy-tamoxifen en het pure anti-oestrogeen ICI 182,780 (fulvestrant) voor een sterke inhibitie van zowel basale celgroei als van ER\ensuremath{\alpha}-gestuurde gentranscriptie. Dit eerder onverwachte resultaat kan verklaard worden door interacties tussen ER\ensuremath{\alpha} en de insulin-like growth factor I (IGF-I) receptor in de \ensuremath{\alpha}T3-1 cellijn. Dit wordt bevestigd door het feit dat IGF-I in staat was om ER\ensuremath{\alpha}-gestuurde genexpressie dosis-afhankelijk te stimuleren. De anti-oestrogeen-ge{\"i}nduceerde inhibitie van basale celgroei en ER\ensuremath{\alpha}-gemedieerde genexpressie werd bovendien geblokkeerd door het toevoegen van stijgende concentraties IGF-I. Een andere belangrijke factor is het feit dat IGF-I in staat was om ER\ensuremath{\alpha} fosforylatie ter hoogte van serine residue 118 te stimuleren. Deze fosforylatie is namelijk {\'e}{\'e}n van de sleutelvoorwaarden voor een optimale ER\ensuremath{\alpha} transcriptionele activiteit. Uit deze data kunnen we afleiden dat IGF-I een invloed kan hebben op ER\ensuremath{\alpha}-gemedieerde signaaltransductie in hypofysaire gonadotropen. Dit wordt bevestigd door een beperkt aantal rapporten in de literatuur, waarin beschreven wordt dat IGF-I LH secretie kan be{\"i}nvloeden. Extra onderzoek is dus noodzakelijk om dit complexe mechanisme verder uit te pluizen. Uit bovenstaande resultaten is gebleken dat de minder gedifferentieerde \ensuremath{\alpha}T3-1 cellijn kan aangewend worden als een in vitro model voor de studie van oestrogene effecten in hypofysaire gonadotropen. In de gedifferentieerde L\ensuremath{\beta}T2 cellijn daarentegen bleken oestrogenen geen invloed te vertonen op LH en FSH productie. Het bestaan van een oestrogeen-responsieve gonadotrope cellijn opent veel mogelijkheden voor het onderzoek naar de mechanismen van oestrogeen-actieve componenten ter hoogte van de gonadotropen. De laatste jaren is er namelijk verhoogde interesse naar het gebruik van fyto-oestrogenen (plantaardige oestrogene stoffen) als alternatief voor de klassieke hormonale substitutietherapie. Meer en meer studies tonen ook aan dat blootstelling aan xeno-oestrogenen (oestrogeen-actieve chemicali{\"e}n aanwezig in het milieu) de vruchtbaarheid negatief kunnen be{\"i}nvloeden. Vanuit de farmaceutische industrie wordt bovendien sterk ge{\"i}nvesteerd in de ontwikkeling van SERMs voor de behandeling van oestrogeen-afhankelijke aandoeningen zoals osteoporose en borstkanker. Aangezien gonadotropen een sleutelrol spelen in de regulatie van de vruchtbaarheid, vormen ze dus een mogelijk doelwit voor dergelijke stoffen. Momenteel wordt in ons laboratorium de \ensuremath{\alpha}T3-1 cellijn aangewend voor de analyse van fyto-oestrogeen ge{\"i}nduceerde effecten ter hoogte van gonadotropen. In hoofdstuk 5.9 tonen we een voorbeeld van een dergelijk experiment. Uit onze studie kunnen we concluderen dat de gedifferentieerde gonadotrope L\ensuremath{\beta}T2 cellijn niet geschikt is voor ons onderzoek omwille van de aangetoonde afwezigheid van enige oestrogene respons. Daarentegen blijkt de minder gedifferentieerde \ensuremath{\alpha}T3-1 cellijn een bruikbaar in vitro model te zijn door de aanwezigheid van een functionele ER\ensuremath{\alpha},zoals aangetoond door middel van proliferatie- en transfectiestudies. De geobserveerde inhibitie van groei- en ER\ensuremath{\alpha}-gestuurde genexpressie kan mogelijk verklaard worden door interacties tussen ER\ensuremath{\alpha} en de IGF-I receptor. Deze data suggereren dat IGF-I een belangrijke rol kan spelen in de regulatie van ER\ensuremath{\alpha}-gestuurde effecten ter hoogte van hypofysaire gonadotropen. Vanuit dit standpunt kunnen we concluderen dat de \ensuremath{\alpha}T3-1 een geschikt in vitro model is voor het onderzoeken van oestrogeen-actieve componenten zoals fyto-oestrogenen, xeno-oestrogenen en SERMs met als finaal doel het moleculaire werkingsmechanisme van deze stoffen ter hoogte van de gonadotropen verder uit te spitten.},
  author       = {Eertmans, Frank},
  school       = {Ghent University},
  title        = {Estrogen Receptor-Mediated Effects in the Gonadotropic LBetaT2 and AlphaT3-1 Cell lines},
  url          = {http://dx.doi.org/1854/10512},
  year         = {2008},
}

Altmetric
View in Altmetric