Advanced search
1 file | 7.56 MB Add to list

Assisted oocyte activation: role of calcium and PLCzeta

(2010)
Author
Promoter
(UGent) and (UGent)
Organization
Abstract
Tijdens de bevruchting van een eicel, zal de zaadcel niet alleen zijn genetisch materiaal binnenbrengen, maar de eicel ook activeren. De eicel is namelijk in rust, geblokkeerd in de metafase van de tweede meïotische deling. Eicelactivatie is een complex proces en omvat naast de afwerking van de meïotische deling (gekenmerkt door de uitstoting van het tweede poollichaampje), de verharding van de zona pellucida, de vorming van de pronucleus en de start van de mitotische celdelingen. Verscheidene theorieën over hoe de zaadcel de eicel activeert werden geformuleerd, maar het is nu algemeen aanvaard dat de zaadcel een eicelactiverende factor in de eicel binnenbrengt, een zaadcel specifiek fosfolipase C, PLCζ. PLCs hydrolyseren het membraan lipide fosfatidylbifosfaat tot diacylglycerol en inositoltrisfosfaat (IP3). Deze laatste gaat binden op de IP3 receptor gelocalizeerd op een gespecialiseerd celorganel, het endoplasmatisch reticulum waardoor Ca2+ vrijkomt in het ooplasma. Deze eerste piek in Ca2+ wordt gevolgd door een hele reeks van pieken of Ca2+‐oscillaties. Ca2+ is een universele secondaire boodschappermolecule en zal Ca2+‐gevoelige eiwitten activeren wat uiteindelijk tot de activatie van de eicel en dus succesvolle bevruchting zal leiden. Intracytoplasmatische sperma injectie of ICSI is een techniek die routinematig in het infertiliteitslabo toegepast wordt voor mannelijke onvruchtbaarheid en waarbij een enkele zaadcel in de eicel gebracht wordt. In de meeste gevallen (70‐80%) leidt dit tot een geslaagde bevruchting, maar bij een klein aantal van de patiēnten wordt geen bevruchting waargenomen. Meer dan tien jaar geleden werd een methode voor het eerst toegepast waarbij na ICSI de Ca2+ concentratie in de eicel op een kunstmatige manier verhoogd wordt door de eicel te behandelen met een Ca2+ ionofoor. Met deze techniek van geassisteerde eicelactivatie of AOA (=assisted oocyte activation) wordt getracht de activatie toch op gang te brengen. Er zijn ondertussen een aantal babies geboren met behulp van deze techniek, maar het gebruik van een chemisch product tijdens de prille fase van de ontwikkeling is nog niet helemaal getest op mogelijke risico’s of schadelijke gevolgen voor de latere ontwikkeling. In deze thesis hebben we enerzijds de veiligheid van de methode onderzocht en anderzijds de zaadcellen van onvruchtbare mannen geanalyseerd. De mogelijke negatieve impact van het Ca2+ ionofoor op de pre‐ en postimplantatie ontwikkeling, maar ook postnatale groei van embryos behandeld met het Ca2+ ionofoor ionomycine werd bestudeerd in de muis. De embryos ontwikkelden normaal en er werd ook geen verschil opgemerkt tussen de pups bekomen van behandelde embryos en controle, niet‐behandelde embryos. Uit dit onderzoek bleek ook dat de activatiemethode die momenteel wordt toegepast in de kliniek behoort tot de meest succesvolle uit een reeks uitgetest op muizeneicellen. Opmerkelijk was dat de eicellen die tweemaal behandeld werden met ionomycine, beter ontwikkelden. Ons onderzoek op menselijke zaadcellen die de eicel niet kunnen bevruchten na ICSI heeft aangetoond dat die zaadcellen geen Ca2+‐oscillaties kunnen veroorzaken in de eicel. De fysiologische Ca2+‐oscillaties worden echter ook niet op gang gebracht door AOA, een methode die wel tot bevruchting, embryo ontwikkeling, zwangerschap en de geboorte van gezonde kinderen leidt. Deze observatie was dan ook merkwaardig en heeft ons er toe gebracht om de resultaten nader te bekijken door middel van een mathematisch model. In het model wordt rekening gehouden met de pathways die de celdeling op gang brengen en de activeit van het CaMKII, een Ca2+‐gevoelig kinase. Uit dit werk hebben we gezien dat twee Ca2+ pulsen de celcyclus effectief terug op gang kunnen brengen door de onomkeerbare destructie van een cytostatische factor die de eicel blokkeert in de metafase. Deze waarneming sluit echter niet uit dat er andere meer subtiele pathways ook beïnvloed worden en eventueel een effect kunnen hebben op latere ontwikkeling. Een normaal te kleine hoeveelheid PLCζ kan voldoende zijn om na blootstelling aan ionomycine toch Ca2+‐oscillaties op gang te brengen, zoals aangetoond voor nog immature zaadcellen. De waarneming dat er geen Ca2+‐oscillaties worden geïnduceerd na behandeling met ionomycine, wijst er dus indirect op dat deze factor in verminderde mate aanwezig is of niet actief is in zaadcellen van onvruchtbare mannen. De analyze van PLCζ in zaadstalen van deze patienten heeft aangetoond dat het eiwit inderdaad in een verminderde hoeveelheid aanwezig is of zich op een abnormale locatie in de zaadcellen bevindt. Er werd bovendien een mutatie in de coderende sequentie van het PLCζ gen ontdekt bij 1 individu. Deze mutatie is een zogenaamde missense mutatie en leidt tot een aminozuur verandering in het actieve deel van het enzyme, wat uiteindelijk een verminderde activiteit van het PLCζ teweegbrengt. In de laatste fase van het onderzoek hebben we zaadcellen van een onvruchtbare muis geanalyseerd om mogelijk te gebruiken als een model. Naar analogie met de menselijke zaadcellen, hebben de muiszaadcellen afwijkingingen in de eicelactiverende factor, PLCζ. Door AOA toe te passen werd de bevruchting van de eicellen hersteld en leidde dit tot normale embryo ontwikkeling en uiteindelijk tot de geboorte van gezonde pups. In dit werk hebben we getracht het process van AOA en de rol van PLCζ beter te begrijpen. De ontdekking van de mutatie in het PLCζ gen is speciaal omdat het de eerste natuurlijke mutatie is die de functie van het PLCζ proteïne drastisch verandert. Het mathematisch model en de onvruchtbare muis kunnen in de toekomst gebruikt worden om de AOA procedure verder te evalueren en te optimaliseren. Daarnaast zal de screening van PLCζ bij meer patiënten bijdragen tot een beter begrip van de rol van PLCζ in onvruchtbaarheid en zal het gebruik van PLCζ tijdens AOA mogelijk een nieuwe oplossing zijn voor gefaalde bevruchting na ICSI.

Downloads

  • (...).pdf
    • full text
    • |
    • UGent only
    • |
    • PDF
    • |
    • 7.56 MB

Citation

Please use this url to cite or link to this publication:

MLA
Heytens, Elke. “Assisted Oocyte Activation: Role of Calcium and PLCzeta.” 2010 : n. pag. Print.
APA
Heytens, E. (2010). Assisted oocyte activation: role of calcium and PLCzeta. Ghent University. Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent, Belgium.
Chicago author-date
Heytens, Elke. 2010. “Assisted Oocyte Activation: Role of Calcium and PLCzeta”. Ghent, Belgium: Ghent University. Faculty of Medicine and Health Sciences.
Chicago author-date (all authors)
Heytens, Elke. 2010. “Assisted Oocyte Activation: Role of Calcium and PLCzeta”. Ghent, Belgium: Ghent University. Faculty of Medicine and Health Sciences.
Vancouver
1.
Heytens E. Assisted oocyte activation: role of calcium and PLCzeta. [Ghent, Belgium]: Ghent University. Faculty of Medicine and Health Sciences; 2010.
IEEE
[1]
E. Heytens, “Assisted oocyte activation: role of calcium and PLCzeta,” Ghent University. Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent, Belgium, 2010.
@phdthesis{4098640,
  abstract     = {Tijdens de bevruchting van een eicel, zal de zaadcel niet alleen zijn genetisch materiaal binnenbrengen, maar de eicel ook activeren. De eicel is namelijk in rust, geblokkeerd in de metafase van de tweede meïotische deling. Eicelactivatie is een complex proces en omvat naast de afwerking van de meïotische deling (gekenmerkt door de uitstoting van het tweede poollichaampje), de verharding van de zona pellucida, de vorming van de pronucleus en de start van de mitotische celdelingen. Verscheidene theorieën over hoe de zaadcel de eicel activeert werden geformuleerd, maar het is nu algemeen aanvaard dat de zaadcel een eicelactiverende factor in de eicel binnenbrengt, een zaadcel specifiek fosfolipase C, PLCζ. PLCs hydrolyseren het membraan lipide fosfatidylbifosfaat tot diacylglycerol en inositoltrisfosfaat (IP3). Deze laatste gaat binden op de IP3 receptor gelocalizeerd op een gespecialiseerd celorganel, het endoplasmatisch reticulum waardoor Ca2+ vrijkomt in het ooplasma. Deze eerste piek in Ca2+ wordt gevolgd door een hele reeks van pieken of Ca2+‐oscillaties. Ca2+ is een universele secondaire boodschappermolecule en zal Ca2+‐gevoelige eiwitten activeren wat uiteindelijk tot de activatie van de eicel en dus succesvolle bevruchting zal leiden. Intracytoplasmatische sperma injectie of ICSI is een techniek die routinematig in het infertiliteitslabo toegepast wordt voor mannelijke onvruchtbaarheid en waarbij een enkele zaadcel in de eicel gebracht wordt. In de meeste gevallen (70‐80%) leidt dit tot een geslaagde bevruchting, maar bij een klein aantal van de patiēnten wordt geen bevruchting waargenomen. Meer dan tien jaar geleden werd een methode voor het eerst toegepast waarbij na ICSI de Ca2+ concentratie in de eicel op een kunstmatige manier verhoogd wordt door de eicel te behandelen met een Ca2+ ionofoor. Met deze techniek van geassisteerde eicelactivatie of AOA (=assisted oocyte activation) wordt getracht de activatie toch op gang te brengen. Er zijn ondertussen een aantal babies geboren met behulp van deze techniek, maar het gebruik van een chemisch product tijdens de prille fase van de ontwikkeling is nog niet helemaal getest op mogelijke risico’s of schadelijke gevolgen voor de latere ontwikkeling.
In deze thesis hebben we enerzijds de veiligheid van de methode onderzocht en anderzijds de zaadcellen van onvruchtbare mannen geanalyseerd. De mogelijke negatieve impact van het Ca2+ ionofoor op de pre‐ en postimplantatie ontwikkeling, maar ook postnatale groei van embryos behandeld met het Ca2+ ionofoor ionomycine werd bestudeerd in de muis. De embryos ontwikkelden normaal en er werd ook geen verschil opgemerkt tussen de pups bekomen van behandelde embryos en controle, niet‐behandelde embryos. Uit dit onderzoek bleek ook dat de activatiemethode die momenteel wordt toegepast in de kliniek behoort tot de meest succesvolle uit een reeks uitgetest op muizeneicellen. Opmerkelijk was dat de eicellen die tweemaal behandeld werden met ionomycine, beter ontwikkelden.
Ons onderzoek op menselijke zaadcellen die de eicel niet kunnen bevruchten na ICSI heeft aangetoond dat die zaadcellen geen Ca2+‐oscillaties kunnen veroorzaken in de eicel. De fysiologische Ca2+‐oscillaties worden echter ook niet op gang gebracht door AOA, een methode die wel tot bevruchting, embryo ontwikkeling, zwangerschap en de geboorte van gezonde kinderen leidt. Deze observatie was dan ook merkwaardig en heeft ons er toe gebracht om de resultaten nader te bekijken door middel van een mathematisch model. In het model wordt rekening gehouden met de pathways die de celdeling op gang brengen en de activeit van het CaMKII, een Ca2+‐gevoelig kinase. Uit dit werk hebben we gezien dat twee Ca2+ pulsen de celcyclus effectief terug op gang kunnen brengen door de onomkeerbare destructie van een cytostatische factor die de eicel blokkeert in de metafase. Deze waarneming sluit echter niet uit dat er andere meer subtiele pathways ook beïnvloed worden en eventueel een effect kunnen hebben op latere ontwikkeling. Een normaal te kleine hoeveelheid PLCζ kan voldoende zijn om na blootstelling aan ionomycine toch Ca2+‐oscillaties op gang te brengen, zoals aangetoond voor nog immature zaadcellen. De waarneming dat er geen Ca2+‐oscillaties worden geïnduceerd na behandeling met ionomycine, wijst er dus indirect op dat deze factor in verminderde mate aanwezig is of niet actief is in zaadcellen van onvruchtbare mannen. De analyze van PLCζ in zaadstalen van deze patienten heeft aangetoond dat het eiwit inderdaad in een verminderde hoeveelheid aanwezig is of zich op een abnormale locatie in de zaadcellen bevindt. Er werd bovendien een mutatie in de coderende sequentie van het PLCζ gen ontdekt bij 1 individu. Deze mutatie is een zogenaamde missense mutatie en leidt tot een aminozuur verandering in het actieve deel van het enzyme, wat uiteindelijk een verminderde activiteit van het PLCζ teweegbrengt.
In de laatste fase van het onderzoek hebben we zaadcellen van een onvruchtbare muis geanalyseerd om mogelijk te gebruiken als een model. Naar analogie met de menselijke zaadcellen, hebben de muiszaadcellen afwijkingingen in de eicelactiverende factor, PLCζ. Door AOA toe te passen werd de bevruchting van de eicellen hersteld en leidde dit tot normale embryo ontwikkeling en uiteindelijk tot de geboorte van gezonde pups.
In dit werk hebben we getracht het process van AOA en de rol van PLCζ beter te begrijpen. De ontdekking van de mutatie in het PLCζ gen is speciaal omdat het de eerste natuurlijke mutatie is die de functie van het PLCζ proteïne drastisch verandert. Het mathematisch model en de onvruchtbare muis kunnen in de toekomst gebruikt worden om de AOA procedure verder te evalueren en te optimaliseren. Daarnaast zal de screening van PLCζ bij meer patiënten bijdragen tot een beter begrip van de rol van PLCζ in onvruchtbaarheid en zal het gebruik van PLCζ tijdens AOA mogelijk een nieuwe oplossing zijn voor gefaalde bevruchting na ICSI.},
  author       = {Heytens, Elke},
  isbn         = {9789081492904},
  language     = {eng},
  pages        = {150},
  publisher    = {Ghent University. Faculty of Medicine and Health Sciences},
  school       = {Ghent University},
  title        = {Assisted oocyte activation: role of calcium and PLCzeta},
  year         = {2010},
}